Pathologie cellulaire : aspect moléculaires et viraux

Biologie des Virus Emergents

Notre groupe a rejoint l’Institut Universitaire d’Hématologie en Janvier 2010. Nos travaux portent sur l’étude des bases moléculaires et cellulaires de l’infection par les flavivirus (virus de la dengue, virus de la fièvre jaune et virus West Nile), un groupe d’arbovirus émergents responsables de pathologies sévères chez l’homme (fièvres hémorragiques, encéphalites). Notre travail consiste à identifier, au moyen d’outils de biologie cellulaire, de virologie ainsi que de technologies à haut débit, les stratégies mises en place par ces virus pour entrer et infecter leur cellule cible.

Trois axes de recherche sont actuellement poursuivis:

1) Récepteurs d’entrée des flavivirus: Nous utilisons plusieurs approches classiques de biochimie et de clonage par expression de banque d'ADNc humaines pour identifier les facteurs d’attachement et les récepteurs cellulaires nécessaires à l’entrée des flavivirus dans les cellules cibles. En parallèle, nous avons récemment développé un système d’expression basé sur l’utilisation de puces à cellules pour le crible à haut débit de gènes humains impliqués dans l’entrée du virus de la dengue. (Collaboration avec Xavier Gidrol, CEA Grenoble, France). Nous utilisons actuellement cette nouvelle technologie pour identifier, parmi une collection de 1800 d’ADNc codant pour des récepteurs de surface, les facteurs requis à l’entrée efficace de souches primaires du virus de la dengue dans les cellules humaines.

2) Routes d’endocytose exploitées par les flavivirus: Nous étudions les mécanismes d’endocytose des flavivirus dans la cellule hôte et recherchons à comprendre le rôle accompli par les lectines de type C exprimées par les cellules dendritiques (DC-SIGN et Langerine) dans le routage des particules infectieuses vers les endosomes acides où s’effectue la fusion des membranes cellulaires et virales. Nous nous intéressons également à la biologie cellulaire de l’ADE (potentialisation de l’infection du virus de la dengue par les anticorps facilitants), un phénomène supposé être à l’origine des formes sévères de la maladie dengue. Nous essayons de définir les bases moléculaires de ce processus et étudions les voies d’internalisation utilisées par les complexes virus-anticorps pour l’infection productive des cellules exprimant des récepteurs aux fragments Fc des immunoglobulines.

3) Facteurs de la cellule hôte impliqués dans le programme d’entrée des flavivirus: Nous utilisons des approches de génomique fonctionnelle pour identifier les facteurs de l’hôte et les voies intracellulaires détournées par les flavivirus pour infecter les cellules cibles. Nous avons récemment terminé un crible à haut débit d’ARN interférant pour identifier les gènes humains impliqués dans le mécanisme d’entrée du virus de la fièvre jaune (collaboration avec le groupe de Lucas Pelkmans, ETH, Zürich). Des études de biologie cellulaire et de virologie sont actuellement en cours au laboratoire pour caractériser les facteurs identifiés et élucider leur fonction au cours des étapes précoces du cycle réplicatif des flavivirus.

Nous espérons ainsi améliorer notre connaissance de la biologie de ces pathogènes et apporter les bases conceptuelles indispensables pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans le futur, nous souhaitons exploiter les outils et l’expertise acquis durant ce projet pour l’appliquer à l’étude de la biologie d’autres virus émergents.

Notre recherche est financée par la Fondation pour la Recherche Médicale, le programme européen CARMUSYS, la ‘Pediatric Dengue Vaccine Initiative’, l’INSERM et l’Institut Universitaire d’Hématologie.

Cancer du Sein

L'intérêt du laboratoire pour le cancer du sein est plus récent. Il est fortement interfacé avec l'équipe hospitalière qui identifie un certain nombre d'anomalies moléculaires récurrentes dans les cancers du sein traités à l'Hôpital St. Louis. Il est également développé en partenariat très étroit avec le service d'anatomo-pathologie et l'unité INSERM 728 (P. Bertheau). Notre objectif est de démembrer cet ensemble très hétérogène, à la fois par des approches de génomiques (transcriptome, CGH), et par la réponse à la thérapeutique. Pour l'instant, nos projets sont tous nés d'observations faites à partir de la typographie moléculaire de ces cancers réalisée dans le laboratoire hospitalier. Au fur et à mesure de son avancement et de la mise en place des systèmes biologiques murins, d'autres questions seront progressivement abordées. Une grande force de ce projet réellement translationnel est sa très étroite imbrication avec l'équipe de diagnostic hospitalier, à laquelle appartiennent la plupart des universitaires impliqués. Ce projet a été très récemment renforcé par des recrutements universitaires et hospitalo-universitaires qui devraient contribuer à son développement et sa dynamique.

Nous avons pu démontrer que la réponse à la chimiothérapie dose-intense nécessite absolument une inactivation de la fonction de P53 (Bertheau et al., 2002; Bertheau et al., 2007). Ce données suggèrent fortement que, contrairement à ce qui était admis à partir de travaux dans des modèles murins, l'activation de P53 par la chimiothérapie n'induit pas l'apoptose, mais un arrêt de cycle. La mort induite par la chimiothérapie serait liée à une catastrophe mitotique, les chromosomes mal répliqués se précipitant en mitose faute d'un arrêt P53-induit en S ou G2/M. Nous avons pu déterminer la signature transcriptionnelle asociée à la mutation de P53. Celle-ci comprend un certain nombre de gènes maîtres du cycle cellulaire, ainsi que des marqueurs de cellule souche.

1) Généralisation des nos observations et affinement des signatures transcriptionnelles.

Pour étendre et généraliser nos observations, nous avons collaboré avec un certain nombre de centres ayant des séries de patientes traitées par différentes associations de chimiothérapie administrée en première ligne et ayant une réponse histologique à la chimiothérapie évaluable (IGR, MDACC, Institut J. Bordet). Nous avons pu réaliser le typage de P53 sur ces échantillons pour lesquels un transcriptome était disponible. Ces travaux nous ont permis de voir que la dépendance de la réponse à la chimiothérapie au statut P53 était variable: complète (notre première étude), absente ou même inverse, selon le type de chimiothérapie. Ceci montre bien à quel point le type d'agent, son dosage et les associations thérapeutiques ont des efficacités variables selon le sous-type tumoral. Ceci laisse espérer qu'à court/moyen terme, une détermination préalable du statut moléculaire d'une tumeur permettra le choix de chimiothérapie la plus adaptée.

La confrontation du statut P53 et du transcriptome sur une série de 330 tumeurs devrait permettre d'affiner considérablement la signature associée à la mutation P53, voire de définir des signatures transcriptionnelles associées aux différents types de mutations. De plus, la mutation P53 est très fortement associée à l'absence d'expression du récepteur aux oestrogènes. Une très grande série nous permettra d'étudier les sous-groupes les plus rares (P53 mutés/ER+ et P53 sauvage/ER-) et de définir leur signature transcriptionnelle.

2) Rôle des mutations P53 dans les cancers basaux du sein

Les cancers basaux du sein représentent une entité clinique très particulière, caractérisée par une très forte agressivité locale et un important pouvoir métastatique. Longtemps définis comme triple négatifs (ER-/PR-/ERB2-), ils sont aujourd'hui définis par d'autres marqueurs (cytokératine 5/6 ou 17, GABARPi…).

Développement du Système Immunitaire

• Développement lymphoïde précoce dans l'espèce humaine
• Régulation négative de la voie de signalisation WNT au cours du développement lymphoïde normal et pathologique

Génome et Cancer

• Oncogenèse des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL)

• Oncogenèse dans la maladie de Fanconi, un syndrome d’instabilité génétique

Facteurs de Transcription NFAT et Cancer du Sein

Notre équipe travaille sur les mécanismes moléculaires responsables de la formation des métastases dans le cancer du sein. Nous étudions plus particulièrement le rôle des facteurs de transcription NFAT dans la régulation de la migration et de l’invasion des carcinomes mammaires, responsables du phénotype métastatique. Nous avons mis en évidence que les facteurs de transcription NFAT sont exprimés et actifs dans les cellules cancéreuses.  Nous avons été les premiers à démontrer que certains isotypes de la famille NFAT, NFAT1 et NFAT5, ont des propriétés pro migratoires et pro invasives alors que d’autres comme NFAT3, dont on retrouve l’expression dans des cancers moins agressifs, ont des propriétés anti migratoires et anti invasives.

Les objectifs actuels de notre travail sont de comprendre à la fois les mécanismes d’activation des facteurs de transcription NFAT et d’identifier les gènes qu’ils régulent pour induire ou bloquer la migration et l’invasion cellulaire. Le but de ces études est de pouvoir proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention et le traitement des métastases dans le cancer du sein.

Leucémie Aiguë Promyélocytaire

La leucémie aiguë promyélocytaire est liée à l'expression du gène de fusion PML/RARA. Cette maladie est très sensible à trois agents thérapeutiques: l'acide rétinoique, l'arsenic et les agents stabilisant l'AMPc. Nous avons montré que ces trois agents ciblent tous PML/RARA. En combinant des approches ex vivo sur des cellules primaires transformées et in vivo chez la souris, nous souhaitons maintenant identifier les domaines exacts de PML/RARA responsables de la transformation cellulaire, ainsi que des effets différenciant ou apoptotiques de ces différents agents. Pour cela, nous allons  I) purifier le complexe contenant PML/RARA à partir de leucémies obtenues chez des souris transgéniques II) analyser l'état de la chromatine des gènes cibles de PML/RARA dans des cellules primaires exprimant PML/RARA ou une collection existante de mutants bien caractérisés ayant perdu des fonctions spécifiques de la fusion III) analyser le comportement ex vivo ou in vivo de cellules exprimant des mutants de PML/RARA dans les deux sites de phosphorylation impliqués dans la réponse à l'AMPc, (S369 et S77 dans RARA) IV)analyser l'effet de la perte aiguë de RXR dans des leucémies établies et étudier l'effet de la réintroduction de mutant informatifs de ce co-facteur essentiel de PML/RARA V) chercher à identifier les cellules clonogéniques dans les leucémies, pour mener des analyses de transcriptome en réponse aux différents agents thérapeutiques VI) mettre en évidence des effets thérapeutiques d'inhibiteurs de phospho-diesterase dans les modèles murins dont nous disposons VII) obtenir un modèle de leucémie PML/RARA induite chez le poisson zébre.

Dans les 10 dernières années, l'équipe a apporté des contributions importantes à la description et à un début de compréhension du rôle des corps nucléaires PML. Nous souhaitons poursuivre cet effort en cherchant I) à comprendre la régulation de la formation de ces domaines par la sumoylation et la présence de domaine de liaison à SUMO dans les protéines PML, ainsi que le rôle des différents paralogues SUMO dans la biogénèse et la dynamique de ces structures II) à élucider le mécanisme de la dégradation de PML par l'arsenic et la sumoylation. III) nous poursuivrons également par des approches de protéomique et de double hybride la recherche de partenaires de régions clefs de PML que nous venons d'identifier.

Dans le domaine du cancer du sein, nous avons mené une approche de génomique descriptive combinée à la détermination d'un nombre important d'annotations cliniques ou thérapeutiques. Ceci nous a par exemple permis de montrer le rôle essentiel de P53 dans la réponse à la chimiothérapie dose-intense. Nous allons poursuivre ces travaux dans 3 axes: I)généralisation de nos observation à d'autres types de chimiothérapie et affinement des signatures transcriptionnelles de la mutation P53, en particulier dans des sous-groupes homogènes II) analyse du rôle des mutations P53 dans les cancers basaux (spectre des mutation, interférence possible avec p63, mise au point d'un modèle animal par transduction rétroviral de mutants de P53 dans des cellules souches mammaires) III) caractérisation fine de l'état du récepteur aux estrogènes dans les cancers du sein (taux de protéine, de transcrit, phosphorylation, variant d'épissage, réponse thérapeutique, transcriptome…).

Le groupe de S. Jauliac, contrat AVENIR autonome, mais intégrée à l'équipe, développe des analyses du rôle des facteurs de transcription NFAT dans l'invasion et la migration des cancers du sein en utilisant plusieurs approches complémentaires: I) rôle de NFAT3 dans l'inhibition de l'invasion des cancers ERA+ II) approches génomique des cibles transcriptionnelle des isoformes NFAT et recherche de gènes maîtres contrôlant invasion et migration III) création de modèles animaux permettant l'étude du rôle des isoformes NFAT dans l'invasion des cellules mammaires transformées IV) régulation de l'activation de NFAT5 par sumoylation.

Relations Hôtes-Pathogènes

Au laboratoire, le Virus Foamy (VF) et le Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) sont des modèles d’étude des étapes précoces de l’infection par les rétrovirus. Nous concentrons particulièrement nos recherches sur les inter-relations complexes qui s’établissent entre un virus et ses cibles cellulaires, au cours de l’infection. En effet, les virus sont des parasites obligatoires qui exploitent les facteurs cellulaires et contrecarrent les mécanismes de défense de la cellule hôte pour se répliquer.

Dans le but de mieux caractériser les étapes précoces du cycle de réplication du VF, nous avons montré que les particules virales utilisent le réseau de microtubules pour rejoindre le centre organisateur des microtubules (MTOC), situé sur leur parcours vers le noyau (1, 2). La protéine Gag, principal composant du core viral, joue un rôle clé dans le routage du VF entrant en recrutant la dynéine, un moteur moléculaire rétrograde (2). Le clivage de la protéine Gag par des protéases cellulaires et virales a lieue au MTOC et provoque le désassemblage du core viral (3). De même, il a été montré que la VIH-1 cible le MTOC de façon précoce après l’entrée dans les cellules. Cependant, les déterminants impliqués dans le transport du VIH-1 ne sont pas encore définis.

En étudiant la localisation des particules virales du VF et du VIH-1 au cours de l’infection dans des cellules quiescentes, qui ne permettent pas une réplication efficace du VF et du VIH-1, nous avons trouvé que les particules virales entrantes se concentrent et persistent au niveau du MTOC pendant plusieurs jours. La réplication virale reprend lorsque les cellules quiescentes infectées sont forcées à se diviser (4, 5), indiquant que le MTOC pourrait représenter un « sanctuaire » où les virus entrant persistent en attendant une stimulation cellulaire mitotique.

Plus récemment, nous avons également montré que Gag de VF est impliqué dans les étapes nucléaires de la réplication virale précédant l’intégration. En interagissant avec les histones H2A/H2B, Gag agit comme facteur d’encrage du génome viral sur la chromatine cellulaire, d’une façon analogue à LEDGF/p75 dans le cas du VIH-1 (7).

Les projets qui sont actuellement en cours visent à répondre aux questions suivantes:

   1.      Rôle de Gag de VF dans le transport nucléo-cytoplasmique des acides nucléiques viraux.

   2.      Rôle des modifications des protéines virales par des enzymes cellulaires durant les phases précoces de la réplication virale.

Rétrotransposition chez la levure : Impact sur le génome et Régulation

Les rétrotransposons, ressemblent aux rétrovirus par leur structure et leur mode de réplication. Ils se répliquent par transcription inverse de leur ARN et intégration de la copie ADN dans les chromosomes. Présents dans les organismes eucaryotes, ils contribuent à la plasticité des génomes. Ils sont à la fois générateurs d’une diversité  phénotypique considérable et à l’origine de nombreuses pathologies liées à des altérations génétiques. Souvent réprimés par  des mécanismes variés agissant aux différentes étapes de leur réplication, les rétrotransposons peuvent être activés dans des cellules exposées au stress. Cette activation, partagée avec d’autres éléments transposables, a conduit B. McClintock à proposer que ces éléments joueraient un rôle évolutif important, surtout en conditions de stress.

Au laboratoire, nous avons pour modèle d’étude le rétrotransposon Ty1 de la levure S. cerevisiae. Nos objectifs principaux sont d’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’activation de Ty1 par les stress environnementaux, leur impact sur le génome et les mécanismes qui contrôlent l’intégration de Ty1.